IMUNOHISTOQUIMICA

INTRODUCAO

    A imunohistoquimica, como técnica, rapidamente se estabeleceu no auxilio ao diagnostico morfológico, desde 70 anos atrás, quando primeiramente foi descrita com uma metodologia simples e limitada. Atualmente, a maioria dos laboratórios de anatomia patológica possui um serviço de imunohistoquimica em sua rotina, com resultados consistentes de alta qualidade que contribuem para o diagnostico, prognostico e tratamento.
    A técnica trata-se da detecção de uma proteína especifica em um corte histológico através de uma reação antígeno-anticorpo que resulta na marcação dessa proteína pesquisada com um cromógeno. Na pratica, a imunohistoquimica é usada para a detecção de marcadores tumorais, de modo a identificar certos tipos histológicos e, quando possível, direcionar o tratamento.

A TECNICA

    A imunohistoquimica foi primeiramente introduzida como um procedimento baseado em fluorescência. A proteína de interesse era identificada diretamente através da ligação de um anticorpo primário marcado com um reagente fluorescente. Embora simples, essa metodologia era limitada por sinalizar proteína por proteína na proporção de 1:1 (nas técnicas mais usadas hoje em dia, a sinalização e amplificada com o uso de anticorpos secundários, ou seja, anticorpos anti-anticorpos, para facilitar visualização) e por exigir produto fresco (não fixado em formol).

    Sistemas de Detecção e Cromógenos

    Moléculas de anticorpos são apenas visíveis quando marcadas. Essa marcação resulta da emissão de fluorescência ou de uma reação enzimática relacionada a um cromógeno. Sistemas de detecção associados a cromógenos comumente usados incluem diaminobenzidina (DAB), 3-amino-9-etil-carbazol (AEC), reagente de Hanker-Yates e A-naftol pironina, que usam peroxidase como substrato enzimático; fast blue, fast red e 5-bromo-4-cloro-3-idolil fostato que usam fosfatase alcalina; tetrazolio e tetrazolio tetranitroazul que usam glicose oxidase; e immunogold que usa acentuação pela prata.
    O desenvolvimento de técnicas de dois ou três passos que amplificam o sinal do antígeno foi uma grande evolução da imunohistoquimica, pois permitiu que pudesse ser aplicada em material parafinizado ou formalizado e melhora a visualização da marcação.

    Anticorpos

    Anticorpos monoclonais de rato têm a propriedade importante de uniformidade, pureza, e mais importante, grande disponibilidade que permitem com que novos anticorpos sejam produzidos para aplicação diagnostica ou terapêutica. Alem disso, são altamente específicos para determinado epitopo, evitando ao maximo reações cruzadas com outras proteínas e conseqüentemente diminuindo o numero de falsos positivos.
    Anticorpos policlonais são produzidos a partir de vários animais, como coelhos e porquinhos da índia, seu uso é bem estabelecido, mas tem a desvantagem de apresentar um maior numero de reações cruzadas por reagir com outros epitopos. São, entretanto, menos custosos que os monoclonais e largamente usados.

METODOLOGIA

    Em imunohistoquimica, existem varias metodologias que podem ser aplicadas para a detecção antigênica. A escolha do método depende basicamente do tipo de amostra utilizada, da disponibilidade do anticorpo primário, do tempo de processamento necessário e do custo dos reagentes.

Método Direto

    Trata-se da metodologia de imunohistoquimica mais simples, na qual um anticorpo primário marcado com fluorescência ou cromógeno reage com determinado antígeno e emite fluorescência ou coloração especifica. Embora simples, nessa técnica não ocorre amplificação do sinal da reação, tornando-a mais complicada de interpretar.

Metodo Indireto

    Nesse caso, o anticorpo primário não é marcado; usa-se, portanto, um anticorpo secundário (ou seja, anti-anticorpo primário) marcado. Dessa forma, essa técnica acontece em dois passos: primeiro, há reação antígeno-anticorpo primário; depois, reação complexo antígeno-anticorpo primário com o anticorpo secundário, que emite fluorescência ou coloração. A vantagem dessa técnica é que há um pouco de amplificação do sinal.

Método Estreptoavidina-biotina-peroxidase (LSAB)

    Essa é a metodologia mais usada, na qual ocorre uma boa amplificação do sinal e trata-se de um método relativamente barato, no qual é usado um cromógeno em vez de fluorescência. Inicialmente, há a reação antígeno-anticorpo primário; depois, um anticorpo secundário marcado com biotina reage com esse complexo; por fim, um complexo protéico de estreptoavidina e peroxidase se liga as biotinas do anticorpo secundário. Esse complexo reage com peróxido de hidrogênio, emitindo uma coloração amarronzada.

Existem outros métodos, nos quais são usados outras enzimas associadas a cromógenos, anticorpos terciários e marcadores fluorescentes. Por ser a mais usada, esmiuçaremos a metodologia acima descrita.

Etapas do Método LSAB

1-    Desparafinização e hidratação das amostras cortadas em laminas de microscopia previamente silanizadas
2-    Recuperação antigênica
3-    Bloqueio da peroxidase endógena
4-    Aplicação do anticorpo primário
5-    Aplicação do anticorpo secundário biotinilado
6-    Aplicação da estreptoavidina-peroxidase
7-    Aplicação do substrato DAB
8-    Contra-coloração
9-    Desidratação e clarificação das amostras, com montagem das laminas
 
      As amostras normalmente encontram-se emblocadas em parafina, depois de terem sido fixadas por formol, desidratadas em álcool e clarificadas com xilol. Essas amostras são então cortadas e adicionadas as laminas silanizadas, isto é, embebidas numa espécie de cola para evitar o descolamento do tecido ao longo dos passos da técnica.
      Primeiramente, essas laminas com as amostras são submetidas a uma bateria de xilol em concentrações decrescentes para retirada da parafina e depois a uma bateria de álcool em concentração decrescente para retirada do xilol e hidratação. Ao fim, as amostras são colocadas em água corrente para hidratação total.
      Quando o material fresco é submetido à fixação em formol 10%, as proteínas celulares sofrem alterações na sua estrutura terciaria e há ainda a formação de ligações cruzadas, tornando o reconhecimento antigênico difícil ou impossível. Dessa forma, depois de reidratadas, as amostras devem sofrer um processo de recuperação antigênica, no qual mudanças de pressão, temperatura e pH quebram a maioria dessas ligações cruzadas e melhor expõem os epitopos alterados pela fixação com formol.
      Terminada a recuperação antigênica, faz-se o bloqueio da peroxidase endógena. Como será melhor explicado adiante, a emissão da coloração acontece quando se aplica o DAB (cromógeno associado a peróxido de hidrogênio), reagindo com a peroxidase associada a estreptoavidina e emitindo cor. As células possuem a enzima peroxidase; se essa enzima não for bloqueada, quando se aplicar o DAB, haverá reação cruzada e ele vai reagir com a peroxidase endógena, de modo que não se terá como descobrir se a reação ocorreu porque houve reação antígeno-anticorpo ou porque reagiu com peroxidase já existente, havendo, assim, muitos falsos positivos. Assim, depois da recuperação antigênica, aplica-se hidróxido de hidrogênio as amostras, de modo que a peroxidase endógena seja esgotada.
      Bloqueada a peroxidase endógena, as amostras são lavadas para retirada do excesso de H2O2 e é aplicado o anticorpo primário. Caso haja o antígeno de interesse, esse anticorpo reage e se liga a ele. Depois, as amostras são re-lavadas para tirar o excesso de anticorpo primário e então se aplica o anticorpo secundário biotinilado. Tendo havido a reação, esse anticorpo secundário reage com o complexo antígeno-anticorpo primário, ligando-se a ele.
      Após a encubação das amostras com os anticorpos, a elas é aplicada a solução de estreptoavidina peroxidase, um complexo protéico que se liga fortemente as moléculas de biotina associadas ao anticorpo secundário. Assim, o cromógeno (DAB) é aplicado, reagindo com a peroxidase associada a estreptoavidina, emitindo coloração. Como sobre um único antígeno foi acrescentado um grande complexo formado por anticorpo secundário e varias estreptoavidinas-peroxidases, haverá uma grande amplificação da marcação, facilitando a interpretação do patologista.
      Os últimos passos consistem em contra-corar a amostra com hematoxilina, para que as estruturas não marcadas possam também ser vistas ao microscópio, e em montar a lamina para analise, ou seja, desidratá-la em bateria de álcool com concentração crescente e depois retirar o álcool em bateria de xilol de concentração crescente. Por fim, coloca-se a lamínula sobre o tecido para conservação da amostra.

Exemplos de imunomarcacao

Aplicabilidade:

1)    Categorização de tumores malignos indiferenciados.

      Em muitos casos, tumores malignos de diversas origens se parecem entre si devido a ma diferenciação. Estes tumores são frequentemente bastante difíceis de distinguir com base nos cortes de rotina de tecidos corados pela HE. Por exemplo, alguns carcinomas anaplasicos, linfomas malignos, melanomas e sarcomas podem parecer bastante similares, mas devem ser cuidadosamente identificados porque seu tratamento e prognostico são diferentes. Anticorpos contra filamentos intermediários demonstraram ter valor nestas situações porque as células tumorais muitas vezes apresentam filamentos característicos de suas células de origem. Por exemplo, a presença de citoqueratina assinala uma origem epitelial (carcinoma), enquanto a desmina é especifica de neoplasias de origem mesenquimatosa.

2)    Categorização de leucemias e linfomas.

      Tumores com origem de linfócitos T e B e a partir de células mononucleares fagociticas freqüentemente só são identificados pela identificação de proteínas de membrana através de imunohistoquimica.

Expressão de CD-23, caracterizando Leucemia Linfocitica Crônica de Células B

3)    Determinação do local de origem dos tumores metastáticos.      Muitos pacientes com doença metastática não tem o local do tumor primário facilmente identificável com as técnicas usuais. Nos casos em que a origem do tumor é obscura, a detecção imunohistoquimca de antígenos específicos do tecido ou do órgão obtido através de biopsia de lesão metastática é capaz de identificar a origem do tumor primário. Por exemplo, o antígeno prostático especifico e a tireoglobulina são específicos de câncer de próstata e tireóide, respectivamente.

Punção positiva para tireoglobulina de tumor metastático da tireóide no pulmão

4)    Detecção de marcadores terapêuticos e prognósticos.
      A maioria das terapias-alvo utilizadas em oncologia são anticorpos ou bloqueadores de receptores específicos que estão alterados em células neoplásicas. Para a aplicação desses medicamentos, essas proteínas devem ser identificadas no individuo acometido pelo tumor, de modo que a quimioterapia ou imunoterapia funcione. Por exemplo, no câncer de mama podem existir receptores de estrógeno e progesterona ou receptor HER2, que respondem bem ao tratamento com tamoxifeno e trastuzumabe, respectivamente. Inibidores de tirosino-quinases, como o erlotinibe (usado quando da amplificação de EGFR) e o imantinibe (usado na presença da oncoproteina bcr-abl traduzida pelo cromossomo Filadélfia na leucemia mieloide crônica) também dependem da imunohistoquimica para sua aplicação.   
      Marcadores de prognósticos também podem ser identificados através de imunohistoquimica. A superexpressao do supressor tumoral p53 em câncer de mama é reconhecido mal-prognostico, pois a proteína normal tem meia vida muito curta, de modo que p53 dificilmente é positivo na imunohistoquimica quando normal; entretanto, mutações nesse gene produzem uma proteína sem função de meia vida longa, sendo assim facilmente detectado. A proteína KI-67 é um bom marcador de proliferação celular, e sua detecção revela neoplasia com alta taxa proliferativa.

Expressão de HER2 em adenocarcinoma de mama

REFERENCIAS

1) LEONG et al. Immunohistology—Past, Present, and Future. Adv Anat Pathol. Volume 17, Number 6, November 2010
2) ALARCAO, Ana. Imunohistoquimica. In: Patologia Molecular em Medicina. 2009
3) RABENHOSRT et al. Protocolos de Imunohistoquimica do Laboratorio de Genetica Molecular – UFC. 2010
4) KUMAR et al. Patologia – Bases Patologicas das Doencas – Rio de Janeiro, 2005.

Eduardo Henrique Cunha Neves Filho

Universidade Federal do Ceara

Graduando em Medicina

Liga de Patologia